Die Genbearbeitung macht einen großen Sprung nach vorne

Bis 2015 hatte sich die Geneditierung - die Fähigkeit, bestimmte Basen in der DNA-Sequenz eines lebenden Organismus zu verändern und im Wesentlichen sein Erbgut anzupassen - von einem komplexen und ineffizienten Laborversuch zum Höhepunkt der klinischen Anwendung entwickelt. Der Fortschritt, der durch ein molekulares Werkzeug namens CRISPR-Cas9 ermöglicht wurde, war geradezu atemberaubend gewesen. Diese leistungsstarke Technologie, die von der amerikanischen Wissenschaftlerin Jennifer Doudna und der französischen Wissenschaftlerin Emmanuelle Charpentier erfunden und vom amerikanischen Forscher Feng Zhang und Kollegen verfeinert wurde, hatte auch langjährigen Diskussionen über die ethischen und sozialen Auswirkungen der Gentechnik neue Dringlichkeit verliehen Menschen. Viele Fragen, wie zum Beispiel, ob die Gen-Bearbeitung zur Behandlung menschlicher Krankheiten oder zur Veränderung von Merkmalen wie Schönheit oder Intelligenz verwendet werden sollte, wurden seit Jahrzehnten in der einen oder anderen Form gestellt. Diese Fragen waren jedoch nicht mehr theoretisch, und die Antworten darauf hatten sehr reale Auswirkungen auf die Humangenetik.

Frühe Versuche, genetische Fehler zu korrigieren.

Die CRISPR-Cas9-Technologie wurde 2012 eingeführt, aber die Idee, Gen-Editing zur Behandlung von Krankheiten oder zur Veränderung von Merkmalen einzusetzen, war viel älter und ging mindestens auf die 1950er Jahre und die Entdeckung von DNA zurück. In der Mitte des 20. Jahrhunderts der genetischen Entdeckung stellten die Forscher fest, dass die Sequenz der Basen in der DNA (meistens) getreu vom Elternteil an die Nachkommen weitergegeben wird und dass kleine Änderungen in der Sequenz den Unterschied zwischen Gesundheit und Krankheit bedeuten können. Das Erkennen letzterer führte zu der unausweichlichen Vermutung, dass mit der Identifizierung von „molekularen Fehlern“, die genetische Krankheiten verursachen, die Mittel zur Behebung dieser Fehler und damit zur Vorbeugung oder Umkehrung von Krankheiten geschaffen würden. Dieser Begriff war die Grundidee der Gentherapie und wurde seit den 1980er Jahren als heiliger Gral in der Molekulargenetik angesehen.

Die Entwicklung der Gen-Editing-Technologie für die Gentherapie war jedoch ein harter Kampf. Viele frühe Fortschritte konzentrierten sich nicht auf die Korrektur genetischer Fehler in der DNA, sondern auf den Versuch, ihre Konsequenzen zu minimieren, indem eine funktionelle Kopie des mutierten Gens bereitgestellt wurde, das entweder in das Genom eingefügt oder als extrachromosomale Einheit (außerhalb des Genoms) beibehalten wurde. Obwohl dieser Ansatz unter bestimmten Bedingungen wirksam war, war er schwierig und in seinem Umfang begrenzt.

Um genetische Fehler wirklich zu korrigieren, mussten die Forscher in der Lage sein, einen doppelsträngigen DNA-Bruch genau an der gewünschten Stelle in den mehr als drei Milliarden Basenpaaren zu erzeugen, die das menschliche Genom bilden. Einmal erzeugt, könnte der doppelsträngige Bruch von der Zelle effizient repariert werden. Es war jedoch nicht einfach, die erste Pause an der genauen Stelle - und nirgendwo anders - innerhalb des Genoms zu machen.

DNA an gewünschten Orten brechen.

Vor dem Aufkommen von CRISPR-Cas9 wurden zwei Ansätze verwendet, um ortsspezifische doppelsträngige Brüche in der DNA herzustellen: einer basierend auf Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und der andere basierend auf Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektor-Nukleasen (TALENs). ZFNs sind Fusionsproteine, die aus DNA-Bindungsdomänen bestehen, die spezifische Sequenzen mit einer Länge von 3 bis 4 Basenpaaren erkennen und an diese binden. Die Übertragung der Spezifität auf eine Zielsequenz mit 9 Basenpaaren würde beispielsweise drei ZFN-Domänen erfordern, die zusammen fusioniert sind. Die Anordnung von DNA-Bindungsdomänen ist auch an eine Sequenz fusioniert, die eine Untereinheit der bakteriellen Nuklease Fok1 codiert. Um einen doppelsträngigen Schnitt an einer bestimmten Stelle zu ermöglichen, müssen zwei ZFN-Fusionsproteine ​​konstruiert werden - eines, das auf jeder Seite der Zielstelle an gegenüberliegenden DNA-Strängen bindet. Wenn beide ZFNs gebunden sind, binden die Fok1-Untereinheiten in der Nähe aneinander und bilden ein aktives Dimer, das die Ziel-DNA auf beiden Strängen schneidet.

TALEN-Fusionsproteine ​​sollen an spezifische DNA-Sequenzen binden, die eine Zielstelle flankieren. Anstatt Zinkfinger-Domänen zu verwenden, verwenden TALENs DNA-Bindungsdomänen, die von Proteinen einer Gruppe von Pflanzenpathogenen abgeleitet sind. Aus technischen Gründen sind TALENs einfacher zu konstruieren als ZFNs, insbesondere für längere Erkennungsstellen. Wie ZFNs tragen TALENs eine Fok1-Domäne, die an die manipulierte DNA-Bindungsregion fusioniert ist. Sobald die Zielstelle auf beiden Seiten gebunden ist, kann die dimerisierte Fok1-Nuklease an der gewünschten Stelle einen doppelsträngigen Bruch einführen.

Im Gegensatz zu ZFNs und TALENs verwendet CRISPR-Cas9 die Erkennung von RNA-DNA-Sequenzen anstelle der Protein-DNA-Bindung, um die Nukleaseaktivität zu steuern, was das Design vereinfacht und die Anwendung auf ein breites Spektrum von Zielsequenzen ermöglicht. CRISPR-Cas9 wurde aus dem adaptiven Immunsystem von Bakterien abgeleitet. Das Akronym CRISPR bezieht sich auf geclusterte, regelmäßig verteilte kurze palindromische Wiederholungen, die in den meisten Bakteriengenomen vorkommen. Zwischen den kurzen palindromischen Wiederholungen befinden sich Sequenzabschnitte, die eindeutig aus den Genomen bakterieller Pathogene stammen. "Ältere" Spacer befinden sich am distalen Ende des Clusters, und "neuere" Spacer, die neuere Krankheitserreger darstellen, befinden sich in der Nähe des proximalen Endes des Clusters.

Die Transkription der CRISPR-Region führt zur Produktion kleiner "Leit-RNAs", die Haarnadelbildungen aus den palindromischen Wiederholungen enthalten, die mit Sequenzen verknüpft sind, die von den Spacern abgeleitet sind, so dass sich jede an ihr entsprechendes Ziel anlagern kann. Der gebildete RNA-DNA-Heteroduplex bindet dann an eine Nuklease namens Cas9 und lenkt diese, um die Spaltung doppelsträngiger DNA an einer Position nahe der Verbindungsstelle der zielspezifischen Sequenz und der palindromischen Wiederholung in der Leit-RNA zu katalysieren. Weil RNA-DNA-Heteroduplexe stabil sind und weil das Entwerfen einer RNA-Sequenz, die spezifisch an eine eindeutige Ziel-DNA-Sequenz bindet, nur die Kenntnis der Watson-Crick-Basenpaarungsregeln erfordert (A bindet an T [oder U in RNA] und C bindet bis G) war das CRISPR-Cas9-System den für die Verwendung von ZFNs oder TALENs erforderlichen Fusionsproteindesigns vorzuziehen.

Anwendungen und Kontroversen.

Bis 2015 wurde CRISPR-Cas9 auf frühe Embryonen angewendet, um genetisch veränderte Organismen zu erzeugen. CRISPR-Cas9 wurde auch bei Labortieren in den Blutkreislauf injiziert, um eine wesentliche Geneditierung in einer Untergruppe von Geweben zu erreichen. Auf CRISPR-Cas9 basierende Ansätze wurden verwendet, um das Genom von Kulturpflanzen, Nutztieren und Labormodellorganismen, einschließlich Mäusen, Ratten und nichtmenschlichen Primaten, zu modifizieren. Das System ermöglichte die Erstellung von Tiermodellen für menschliche Krankheiten und die Entfernung von HIV aus infizierten Zellen. In einem Mausmodell einer menschlichen Krankheit wurde CRISPR-Cas9 verwendet, um einen genetischen Fehler erfolgreich zu korrigieren, was zur klinischen Rettung erkrankter Mäuse führte. Es schien, dass es nur wenige, wenn überhaupt, unüberwindbare technische Einschränkungen bei der Bearbeitung von CRISPR-Cas9-Genen gab.

Im Jahr 2015 befürwortete eine Gruppe von Wissenschaftlern, zu denen auch Doudna gehörte, Zurückhaltung bei der Anwendung der CRISPR-Cas9-Technologie auf den Menschen, zumindest bis die sicherheitstechnischen und ethischen Auswirkungen der Bearbeitung menschlicher Gene angemessen berücksichtigt werden konnten. Andere Forscher rieten zu einem „Full-Steam-Ahead“ -Ansatz und argumentierten, dass die neue Technologie der Schlüssel zur Linderung vieler menschlicher Leiden sei und dass es unethisch wäre, sie zurückzuhalten. Ende April gab Francis Collins, Direktor der US National Institutes of Health (NIH), eine Erklärung ab, in der er erklärte, dass das NIH weiterhin Forschung mit Gen-Editing-Systemen, einschließlich CRISPR-Cas9, finanzieren werde. Das NIH würde jedoch keine Forschung finanzieren, die die Geneditierung menschlicher Embryonen umfasst. Anfang Mai tauchten jedoch bereits Berichte aus China über Gen-Editing-Experimente an menschlichen Embryonen auf. Es ist klar, dass die CRISPR-Cas9-Geneditierung zumindest in einigen Ländern verwendet wird, um das menschliche Genom zu modifizieren. Die positiven und negativen Folgen dieser Aktivitäten wurden als potenzielle Neudefinition der Zukunft der Humangenetik angesehen.